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干式恒温金属浴进行定性和定量分析

发布日期:2020-04-18 18:14  浏览次数:

7<位半胱氨酸形成 %个链 间二硫键。干式恒温金属浴 !!!!!!!!!!!!! #%%%%%%%%# $ $$$ $$ 5链:!!甘=异=缬=谷=谷胺=半=半=苏=丝=异=半=丝=亮=酪=谷胺=亮=谷=天=酪=半=天胺 7> $ $$79 7> %7 !!!!!!!!!!!!!!! #!!!!!!!!!!!!!!!!! !# $ $$$ $$ ## $ $$$ $$ 6链:苯丙=缬=天胺=谷胺=组=亮=半=甘=丝=组=亮=缬=谷=丙=亮=酪=亮=缬=半=甘=谷=精=甘=苯丙=苯丙=酪=苏=脯=赖=苏 7 > 79 7> %9 %> 89 图 % 4!人胰岛素的一级结构 ! !(二)多肽链的氨基酸序列分析 ! !蛋白质一级结构的确定是研究蛋白质结构及其作用机制的前提。比较相关蛋白质的一级结构对于研 究蛋白质的同源性和生物体的进化关系是必需的。蛋白质的氨基酸序列分析还有重要的临床意义,可以 发现因基因突变造成蛋白质中氨基酸差异所引起的疾病。 ! ! 7<>8年 ?)[email protected])*1A #,BC3)首先采用 %,4二硝基氟苯(7 DE0F)F %,4 @*B*/)FG3BH3B3,?I$6)法,用了 79年时间,成功地完成了牛胰岛素的序列分析。现在,随着自动分析仪的问世,人们可以用很短时间确定 一个蛋白质的一级结构。氨基酸测序的基本方法是在 #,BC3)测序法的基础上,由 ’3J) K@+,B改良的 [email protected] +,B降解法(K@+,B @3C),@,/*FB)。其基本实验步骤分以下三步。 第二章 !蛋!白!质!! ! !"#测序前的准备工作 !!在进行氨基酸序列分析之前,首先用 $末端分析法确定蛋白质所含多肽链的数目,断裂二硫键,分离 纯化单一的多肽链。再将单一多肽链彻底水解,以分析其氨基酸组成(种类与数量)。目前,多采用氨基 酸自动分析仪,利用高效液相色谱法(%&’% ()*+,*-./0) 1&23&4 0


%*,-.5,’*.(%6,789:)或离子交换色谱法对 溶液中游离的氨基酸进行定性和定量分析(图 ;<)。各种蛋白质的氨基酸组成可作为鉴别不同蛋白质 的“指纹”,也可用于比较不同实验室对同一蛋白质测序结果的一致性。 图 ; 61 0%1,*&4))作为 $端氨基酸的标记 物,由于丹酰基有强荧光,可以大大提高检测的灵敏度。 ! !羧基端的检测常采用羧基肽酶法。控制反应条件,使 :端氨基酸逐一释放出来,予以检测。 ! ! ?#多肽链的氨基酸序列测定和重叠组合 ! !多肽链的序列测定常采用 @4-./降解法。理论上,此法适用于长度在 ?A B CA氨基酸残基以下的多 肽链。所以,在对多肽链进行测序前,先将多肽链用几种方法进行限制性水解,生成相互有部分重叠序列 "!第一篇 &生物分子的结构与功能 的一系列短肽链,用 !"#$%降解法对每个短肽进行测序。最后,将不同方法水解产生的肽链进行比较,找 出重叠部分,进行累加,拼出完整的多肽链序列。 &&多肽链的水解方法很多(表 ’()。胰蛋白酶水解碱性氨基酸羧基形成的肽键;胰凝乳蛋白酶水解芳 香族氨基酸羧基形成的肽键,等等。水解后的肽片段可用色谱和电泳加以分离。 表 ! "#常用的多肽链水解方法与作用点 水解肽段的酶或试剂对被水解


肽段羧基侧 )基团的要求 胰蛋白酶精、赖 胰凝乳蛋白酶芳香族氨基酸:苯丙、酪、色 金黄色葡萄球菌内肽酶 * + 谷 溴化氰蛋 亚磺酰基苯甲酸色 & & !"#$%降解反应又称 !"#$%循环。肽段的 ,端氨基与异硫氰酸苯酯( -./%01 2345.2460$%$5/,789:)在 弱碱性条件下反应,生成苯氨基硫甲酰肽。然后,用冷盐酸水解肽链末端的氨基酸衍生物,生成苯乙内酰 硫脲氨基酸(-./%015.24.0";$%542% $#2%4 $62",79<氨基酸)和 ,端少一个氨基酸的多肽。此氨基酸衍生 物可通过色谱分离,与标准氨基酸衍生物对比,鉴定出 ,端第一个氨基酸的种类。再对少一个氨基酸的 肽段进行同样的 !"#$%降解反应,确定第二个氨基酸的种类。如此反复进行,便可确定此肽段从 ,端到 :端的氨基酸序列(图 ’=)。 图 ’ =& !"#$%降解法原理 & &最后,将不同方法水解的肽段序列进行组合、叠加,得出完整肽链的一级结构。 & &除了 !"#$%降解法外,人们利用反转录聚合酶链反应( ;/>/;3/ 5;$%36;2-524% -410#/;$3/ 6.$2% ;/$6524%, 第二章5蛋5白5质"! !" #$!)从编码蛋白质的 %!&’得到其互补 (&’( )(&’)序列,再根据遗传密码表反推出其相应的氨

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