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干式恒温金属浴基因有关的操作

发布日期:2020-04-18 18:14  浏览次数:

! ! "#什么是癌基因、原癌基因和抑癌基因? !干式恒温金属浴 ! $#什么是原癌基因的激活?举例说明原癌基因激活的几种方式。 ! ! %#简述癌基因表达产物及其作用。 ! ! &#简述肿瘤的发生与癌基因和抑癌基因之间的关系。 ! ! ’#什么是生长因子?其主要作用方式有哪些? (汪 !渊) 第十七章 !基因技术 !!本章教学要求 !! "基因工程所需的酶类、载体和操作过程 !! "分子杂交的概念、探针、分子杂交的种类和应用 !! " "#$的原理、操作过程和应用 !! " %&’序列分析的原理 !! "转基因动物、克隆动物、基因剔除的概念 !! "基因诊断和基因治疗的基本概念、方法和意义 !!本章所谓的“基因技术”是指与基因有关的操作技术,包括基因工程、分子杂交、聚合酶链反应、 %&’ 序列测定、转基因动物、克隆动物、基因剔除技术、基因诊断和基因治疗等。 第一节 !基因工程 !!重组 %&’技术(()*+,-./0/1 %&’ 1)*2/+3+45)是指在体外按人们的意愿将不同的 %&’分子重组的技 术。基因工程(4)/)1.* )/4./))(./4)是指利用重组 %&’技术将目的基因和载体重组,再导入受体细胞内进 行扩增和表达的过程。克隆(*3+/))是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。基因 工程相当于目的基因的无性繁殖过程,也称其为基因克隆( 4)/) *3+/./4)。由于这是在分子水平上进行的 操作,因此还称为分子克隆(,+3)*630( *3+/./4)。 一、基因工程操作中常用的工具 !!(一)工具酶 ! !78限制性内切酶 !!限制性内切核酸酶(()91(.*1.+/ )/:+/6*3)09))简称限制性内切酶或限制酶,是一类能识别和切割双链 %&’分子中特定碱基序列的核酸水解酶。限制性内切酶都是在细菌


中发现的。限制酶与其相应的甲基 化酶组成了细菌的限制修饰系统。限制酶能识别外来 %&’的特定序列并把 %&’切断,防止外来 %&’ 的侵入。相应的甲基化酶将细菌自身 %&’中限制酶识别的序列甲基化,使限制酶不再识别这段序列,对 自身的 %&’加以保护。限制酶共有三种类型。 !型限制酶是复合酶,具有限制和修饰的双重功能和 ’;" 酶、解旋酶活性。 "型限制酶和 !型限制酶性质相似,但缺少 ’;"酶和解旋酶的活性。这两种限制酶在 基因工程中的用途都不大。 #型限制酶能识别双链 %&’的特异序列并在该序列内将 %&’切断。基因工 程操作中使用的限制酶主要是指 #型限制性内切酶。 !!限制性内切酶一般识别双链 %&’的 < =>个核苷酸顺序,以识别 ?个核苷酸顺序的限制性内切酶最 为多见。如果 %&’的核苷酸顺序随机排列,对于识别 <个核苷酸的酶来说大约每 @A?个核苷酸就有一个 切点。识别 ?个核苷酸的酶每 < BC?个核苷酸就有一个切点。 !!限制酶切割 %&’后,在断端的 AD端带有磷酸基, ED端带有羟基,切口断端有两种类型:黏性末端(AD突 出端和 ED突出端)和平端。 #"! 第三篇 !遗传信息的传递 # ! !"#突出端:如 !"#$!! !"#—%&&’’( —)# )#—(’’&&% —"# , # ! !)#突出端:如 $%&!! ! "# (’%(&% )# )# %&(%’( "# , # !!平端: !如 ’()"! ! ! "# %’’&&( )# )# (&& ’’% "# , !!用同一种限制酶切割的异源 *+&片段产生相同的黏性末端,称为同源黏性末端。有些限制酶识别序 列虽然不同,但酶切后可以产生相同的黏性末端,称为同尾酶( ,-./01203453),如 *)+6!( %#%&’(()和 *,-"(&#%&’(’)。 !!限制酶的命名方法是第一个字母大写代表细菌的属名( 7541-),第二、三个字母小写代表细菌的种名 (-85/,5-),若细菌有变异株或不同品系,则再用一个大写字母表示株或型( -930,4)。如果同一菌株中有几 种限制酶则根据发现的先后用大写的罗马数字表示。如 !"#$ !是从 !%"./01".1) 2#-1 $:;)株中分离的 第一种限制酶。 ! ! <= ’>*+&连接酶 ! ! ’> *+&连接酶(’> *+& ?,70-5)是从 ’> 噬菌体感染的大肠杆菌中分离的一种单链酶,相对分子质量 @A BBB,能催化 *+&中邻近的 )#端羟基和 "#端磷酸基间形成磷酸二酯键。在基因工程中用于互补黏性末端 和平端 *+&分子之间的连接。反应体系中需要 &’C和 D7离子。 ! !)=大肠杆菌 *+&聚合酶 ! !!大肠杆菌 *+&聚合酶 !是从大肠杆菌中分离的单链蛋白质,相对分子质量 ;BE BBB,此酶具有


 "#!)# 的聚合作用, "#!)#外切作用和 )#!"#的外切作用。此酶经枯草杆菌蛋白酶消化产生一大一小两个片段, 大片段也叫 F?54.G片段,失去了 "#!)#的外切功能。 ! !>=逆转录酶 !!逆转录酶又叫依赖 $+&的 *+&聚合酶。目前已从多种肿瘤病毒中分离到这种酶。在基因工程中的 主要用途是以 H$+&为模板合成互补 *+&即 /*+&,用于组建 /*+&基因文库。逆转录酶能催化以 $+& 为模板的 *+&聚合作用;它的 )#!"#外切活性能特异的降解 $+& *+&杂交分子中的 $+&部分;它还 具有 *+&引导的 *+&聚合酶活性。 ! !"= ’> 多核苷酸激酶 ! ! ’> 多核苷酸激酶(’> 8.?I41/?5.9,25 J,40-5)是从 ’> 噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。它能催化 &’C 的 #磷酸转移到 *+&或 $+&的 "#端羟基上。此酶主要有两种用途,一是用放射性磷标记 *+&链的 "# 端;二是使缺少 "#磷酸的 *+&磷酸化,用于连接反应。 ! !@=碱性磷酸酶 !!从细菌中分离的碱性磷酸酶( 0?J0?,45 8K.-8K090-5)简称 &LC,从小牛肠中提取的碱性磷酸酶简称 (&C。此酶能特异的切除 *+&或 $+&"#端的磷酸基产生 "#端羟基以防止载体的自身连接。 ! !M=末端脱氧核苷酸转移酶 !!末端脱氧核苷酸转移酶(953H,40? 25.NI41/?5.9,2I? 9304-O530-5)简称末端转移酶,是从小牛胸腺中分离, 能催化单核苷酸转移到 *+&的 )#端的羟基上,末端转移酶的模板是带有 )#端羟基的单链 *+&( --*+&) 或有延伸 )#羟基末端的双链 *+&(2-*+&)。 !!(二)载体 第十七章

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